大肠杆菌HPLA生产菌株构建
使用引物从Cupriavidus necator JCM20644的基因组DNA中扩增乳酸脱氢酶基因（ldhA）。将NdeI-XhoI消化的扩增片段引入pET21a-FRT的相应位点，构建pARO133。使用pARO133作为模板，通过PCR扩增含侧翼扩增两个FRT位点和ldhA的km盒（FRT-Km-FRT-ldhA），然后将其引入染色体上的acs基因座，产生菌株AR-G39（FRT-Km-FRT-T7p-ldhA）。通过P1转导组装遗传性状，并通过FLP/FRT重组切除卡那霉素抗性标记以产生芳香化合物生产者。将菌株AR-G39的遗传性状（acs:：FRT-Km-FRT-T7p-ldhA）转入来源于大肠杆菌菌株BW25113（DE3）的AR-G2（tyrR：：T7p-aroFfbr-tyrAfbr）中4HPLA生产者PAR-3。
参考文献：Koma D, Yamanaka H, Moriyoshi K, Ohmoto T, Sakai K. Production of aromatic compounds by metabolically engineered Escherichia coli with an expanded shikimate pathway. Appl Environ Microbiol. 2012 Sep;78(17):6203-16.
大肠杆菌HPLA生产菌株构建
使用引物从Cupriavidus necator JCM20644的基因组DNA中扩增乳酸脱氢酶基因（ldhA）。将NdeI-XhoI消化的扩增片段引入pET21a-FRT的相应位点，构建pARO133。使用pARO133作为模板，通过PCR扩增含侧翼扩增两个FRT位点和ldhA的km盒（FRT-Km-FRT-ldhA），然后将其引入染色体上的acs基因座，产生菌株AR-G39（FRT-Km-FRT-T7p-ldhA）。通过P1转导组装遗传性状，并通过FLP/FRT重组切除卡那霉素抗性标记以产生芳香化合物生产者。将菌株AR-G39的遗传性状（acs:：FRT-Km-FRT-T7p-ldhA）转入来源于大肠杆菌菌株BW25113（DE3）的AR-G2（tyrR：：T7p-aroFfbr-tyrAfbr）中4HPLA生产者PAR-3。
参考文献：Koma D, Yamanaka H, Moriyoshi K, Ohmoto T, Sakai K. Production of aromatic compounds by metabolically engineered Escherichia coli with an expanded shikimate pathway. Appl Environ Microbiol. 2012 Sep;78(17):6203-16.