使用引物组对pKD3的FRT Cmr FRT和trc启动子操作区进行PCR扩增。通过剪接重叠延伸PCR将两个DNA扩增子融合在一起，使用正向引物和反向引物产生frt-Cmr-frt-ptrc盒。为了生成用于基因组整合的DNA盒，对FRT-Cmr-FRT-Ptrc盒进行PCR扩增，引物组包含36 bp的5’和3’同源臂，使得FRT-Cmr-FRT-Ptrc盒能精确地插入Sbm操纵子的上游。通过P1噬菌体转导将基因敲除引入CPC-Sbm。为了消除共转导的FRT-Knr-FRT盒，用pCP20转化转导突变体，pCP20是一种表达翻转酶重组酶的温度敏感质粒。在Flp介导的Knr cas-sette切除后，产生了一个单一的Flp识别位点。然后通过在42°C下培养细胞来去除质粒pCP20。从pSOS95中PCR扩增出含有Pthl启动子控制下的含有梭菌adc基因的Rho非依赖性转录终止子的DNA片段。然后将扩增的DNA片段亚克隆到pTrc99a的EcoRV和EcoRI限制性位点，以产生pCtfAB-adc。为了产生对照质粒pCtfAB，使用引物从pSOS95中PCR扩增出Pthl启动子控制下的ctfA-ctfB，并将扩增片段克隆到pTrc99a的EcoRV和EcoRI限制位点。为了产生对照质粒pAdc，使用引物对Pthl进行PCR扩增，而使用引物从pSOS95进行PCR扩增adc。然后使用Gibson酶组装将两个扩增子融合，并克隆到pTrc99a的EcoRV和EcoRI限制性位点。使用针对phaA的C-phaA1引物组和针对bktB的C-bktb1引物组，从野生型C.necator菌株的基因组DNA中PCR扩增出两个酮硫解酶基因。为了产生质粒pK-PhaA，在Plac启动子的控制下携带PhaA基因，使用Gibson酶组装将PhaA扩增子与PCR线性化的pK184融合。选择phaA片段相对于Plac启动子具有正确转录方向的克隆，并通过DNA测序进行验证。使用相同的方法生成质粒pK-BktB，该质粒在Plac启动子的控制下携带BktB基因。为了生成含有-酮硫解酶的DNA盒，首先分别使用C-phaA2和C-bktb2引物组从C.ne cator ATCC 17699基因组DNA中单独PCR扩增PhaA和BktB。然后，使用c-phaA2的正向引物和c-bktb2的反向引物，通过剪接重叠延伸PCR将这两个DNA片段转录融合。将所得融合片段克隆到pK184的EcoRI限制性位点。

参考文献：Srirangan K, Liu X, Akawi L, Bruder M, Moo-Young M, Chou CP. Engineering Escherichia coli for Microbial Production of Butanone. Appl Environ Microbiol. 2016 Apr 18;82(9):2574-2584.