噬菌体展示技术原理解析

一、噬菌体展示介绍

噬菌体展示技术(phage display technology)的本质是一种筛选技术。将不同的外源基因分别插入噬菌体载体中，随着噬菌体的传代，外源蛋白会展现在噬菌体表面，形成噬菌体文库。随后用特定蛋白对噬菌体文库进行筛选，便可快速地得到与该蛋白具有高度亲和力的抗体。

丝状噬菌体

应用价值：

·开发单克隆抗体：如用于癌症治疗、自身免疫病；

·发现新药靶点；

·研究蛋白质相互作用；

·生物传感器开发；

·疫苗设计。

二、噬菌体展示技术原理

噬菌体展示技术的原理，是将一段外源基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正常且不影响外壳蛋白正常功能的情况下，外源基因会随着外壳蛋白的表达而表达，从而使多肽或蛋白以融合蛋白的形式展现在噬菌体表面。

被展示的蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，有利于靶蛋白的结合，因而可以利用靶蛋白快速地进行噬菌体展示抗体库的筛选。在展示文库构建完成后，以靶蛋白为固定相，和展示文库共同孵育一段时间，洗去未结合噬菌体，再以竞争受体洗脱特异性结合的噬菌体。洗脱得到的噬菌体感染宿主菌繁殖扩增，然后进行下一轮洗脱。经过3~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，便可以得到能与靶蛋白特异性结合的噬菌体的高度富集(对于某些亲和力较弱的抗体，可能需要 6~8 轮筛选以富集)。

筛选得到的高度亲和力的噬菌体集合中可能含有多个克隆，可以利用ELISA或Western Blot进一步对得到的外源蛋白进行筛选，或对蛋白进行铺盘分离单克隆菌株，从而得到特异性的单克隆抗体，进而进行生物学方面研究。

噬菌体展示技术的核心流程

注：部分载体（如噬菌粒）需辅助噬菌体提供外壳蛋白，才能完成噬菌体包装。

三、常用噬菌体分类

在技术应用中，丝状温和噬菌体（如M13）是“噬菌体展示”的主角，烈性噬菌体（如T4）则是“噬菌体疗法”的主力。

四、噬菌体展示技术的优势与不足

优势：

• 筛选效率高：噬菌体展示技术是一种高效率的筛选技术，通过多轮筛选可获得特异性结合目标抗原的抗体。
• 多样性：可以构建具有高多样性的抗体库，覆盖广泛的抗原表位。
• 无需动物免疫：不需要进行动物免疫，减少了实验周期和成本。
• 高通量：可以进行高通量筛选，一次筛选可以处理大量的抗体候选分子。
• 直接获得功能相关序列：通过将抗体的DNA序列与表型直接联系起来，可快速获得具有所需功能的抗体序列。

不足：

由于受到细菌转化效率的限制，常规电转方法下建立天然噬菌体抗体库的库容量通常在10^7左右，噬菌体库容量可能受到细菌转化效率的限制但通过噬菌粒与高效电转化，可达10¹⁰ 以上。此外，从天然抗体库中筛选到的抗体亲和力可能较低，需要进一步优化。

五、噬菌体展示技术与其他抗体制备方法对比

目前主流的抗体筛选方法有5种：
① 杂交瘤（经典鼠源）、
② 噬菌体展示（高通量人源）、
③ 酵母展示（精准分选）、
④ 单B细胞克隆（天然配对）、
⑤ 转基因小鼠（体内人源）。
它们各有优劣，常组合使用——比如先用噬菌体初筛，再用酵母优化，最后用单B细胞验证。

补充：

新兴/辅助技术

核糖体展示（Ribosome Display）：无细胞系统，库容量超大（>10¹²），用于极端亲和力筛选；

·mRNA展示（mRNA Display）：共价连接蛋白与mRNA，稳定性高；

·AI辅助抗体设计：如DeepMind的AlphaFold、生成式AI预测CDR结构，正在改变筛选范式。

目前尚未完全替代噬菌体展示，多作为补充工具用于特定场景（如超大库容量筛选、高亲和力优化）。

六、噬菌体展示技术的步骤

从一个包含数十亿种不同蛋白（通常是抗体片段）的库中，筛选出能特异性结合某个靶标（如癌细胞蛋白、病毒抗原）的“最佳候选分子”。

噬菌体抗体库技术的筛选步骤

1、抗体库的构建流程（从组织到噬菌体文库）

这是噬菌体展示技术的 “源头”，核心是获取抗体基因并构建成可展示的噬菌体文库。

(1) 样本采集与RNA 提取从免疫后的动物（或人）脾脏 / 外周血组织中提取总 RNA，这是抗体基因的原始模板。

(2) 抗体基因扩增与拼接通过RT-PCR 扩增出抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），再通过拼接技术（如重叠延伸 PCR）将 VH 和 VL 连接成单链可变区（scFv）—— 这是抗体的核心抗原结合片段，也是噬菌体展示中最常用的抗体形式。

(3) 噬菌粒载体构建将拼接好的scFv 基因插入到噬菌粒载体中，再通过电转技术导入大肠杆菌，构建出包含百万级以上不同抗体基因的抗体基因文库。

(4) 噬菌体文库扩增加入辅助噬菌体（Helper phage），让大肠杆菌包装出携带 scFv 基因的噬菌体颗粒，最终得到可用于筛选的噬菌体抗体库。

2、多轮筛选与阳性克隆鉴定（从文库到目标抗体）

这是噬菌体展示技术的 “核心筛选环节”，通过多轮淘洗富集高亲和力的目标噬菌体。

第 1 轮：噬菌体库与靶标结合将噬菌体抗体库与固定在固相载体（或细胞表面）的靶标抗原混合，让展示在噬菌体表面的 scFv 与抗原特异性结合。

第 2 轮：吸附与洗涤吸附后，用缓冲液洗去未结合或非特异性结合的噬菌体，只保留能稳定结合靶标的阳性噬菌体。

第 3 轮：洗脱阳性噬菌体通过改变 pH 或加入竞争抗原，洗脱结合的阳性噬菌体，得到第一轮富集的噬菌体。

第 4 轮：感染扩增与重复淘洗将洗脱的阳性噬菌体感染大肠杆菌，加入辅助噬菌体进行扩增，得到新一轮的噬菌体库。重复 “结合 - 洗涤 - 洗脱 - 扩增” 流程 2-4 轮，每一轮都会提高筛选的严格性，最终富集出高亲和力的阳性噬菌体。

第 5 轮：阳性克隆鉴定与表达从富集的噬菌体中挑取单个克隆，通过测序、ELISA 或流式细胞术（FACS）鉴定其结合活性，最终筛选出能精准结合靶标的抗体基因，并在宿主细胞中表达出目标抗体蛋白。

七、噬菌体展示技术的分类（按载体噬菌体的类型划分）

噬菌体展示的载体是改造后的噬菌体 / 噬菌粒，不同噬菌体的基因组特点、展示容量、展示位置、增殖效率不同，适配展示的蛋白类型（短肽 / 抗体 / 完整蛋白）也不同，主流分 4 类，其中M13 丝状噬菌体是抗体 / 多肽筛选的黄金载体。

1. M13 丝状噬菌体展示系统（含 f1、fd 噬菌体）

M13 噬菌体感染大肠杆菌（Escherichia coli）的过程

核心特点：

·单链 DNA 噬菌体，增殖温和（不裂解宿主菌，宿主菌可继续生长），易实现可溶性蛋白的表面展示；

·展示容量中等（可展示短肽、抗体片段 scFv/Fab、小型酶蛋白，不适合超大型完整蛋白）；

·展示位置固定（主要融合在外壳蛋白 pⅢ、pⅧ 上：pⅢ 展示适合高亲和力筛选，pⅧ 展示适合高通量文库筛选）；

·操作简单、文库容量大（可构建 10¹⁰+以上的大容量文库，适配百万级抗体 / 多肽筛选）。

适配场景：

·抗体片段（scFv/Fab）、多肽、小型功能蛋白的展示与筛选。

核心优势：

·是目前应用最广泛、技术最成熟的系统，也是生物药研发、诊断试剂探针筛选的首选。

2. λ 噬菌体展示系统

核心特点：

·双链 DNA 噬菌体，增殖方式分溶源型（温和）/ 裂解型，展示容量大（可展示完整大分子蛋白、多亚基蛋白复合物，如酶、受体蛋白）；

·展示位置主要在尾部蛋白 pⅥ、头部蛋白 D，适合展示结构复杂的蛋白。适配场景：完整功能蛋白、蛋白复合物、大型酶蛋白的展示与筛选（如酶工程中高活性酶的筛选，你的菌株改造 / 酶制剂研发可关联）。

局限：

文库容量较小（10⁶~10⁷），筛选效率低于 M13 系统，操作相对复杂。

3. T7 噬菌体展示系统

核心特点：

·双链 DNA 烈性噬菌体（裂解宿主菌增殖），展示容量超大（可展示任意大小的蛋白，包括超大型完整蛋白、膜蛋白、毒性蛋白）；

·展示为非融合型展示（蛋白直接连接在外壳蛋白上，不影响蛋白天然构象），适合展示易变性、结构敏感的蛋白。

适配场景：

大型完整蛋白、膜蛋白、毒性蛋白、难折叠蛋白的展示与筛选（如基因治疗中病毒载体蛋白、膜受体蛋白的筛选）。

局限：

裂解宿主菌导致无法连续培养，文库构建难度稍高，暂不适合常规抗体 / 多肽的高通量筛选。

4.噬菌粒展示系统

噬菌粒 - 辅助噬菌体系统中单价抗体展示的机制

核心特点：

·不是天然噬菌体，是噬菌体复制区 + 质粒复制区的人工融合载体（兼具噬菌体和质粒的优点），属于“噬菌体 - 质粒杂合载体”；

·本身不表达外壳蛋白，需与辅助噬菌体（如 M13KO7） 共转染宿主菌，才能包装成有展示功能的噬菌体颗粒；

·展示容量灵活、操作简便，可通过调节辅助噬菌体浓度，实现单拷贝 / 多拷贝展示（单拷贝适合高亲和力筛选，多拷贝适合高通量初筛）。

适配场景：

抗体片段、多肽的高通量筛选（是 M13 系统的升级版，目前实验室 / 工业研发中最主流的抗体筛选载体，你的业务中实际使用的基本是这个系统）。

核心优势：

比纯 M13 噬菌体更易改造、文库更稳定，是抗体基因文库构建的首选载体。

泰斯拓生物在噬菌体展示抗体库构建和筛选方面积累了丰富的经验，凭借自主优化的噬菌体抗体库技术平台，能够为客户提供全面的噬菌体展示文库构建和筛选服务，涵盖鼠源、兔源、鸡源单克隆抗体以及全人源抗体等多个种属。基于该平台，我们已成功高效筛选并表达了多种类型的抗体，包括Fab抗体、scFv单链抗体、纳米抗体（VHH）等。

相关产品：

1、大肠杆菌（Escherichia coli）

2、辅助噬菌体 M13KO7 

参考文献：

1. [1]SMITH G P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J]. Science, 1985, 228(4705): 1315-1317. https://doi.org/10.1126/science.4001944. PMID:4001944.

2. [2]PARMLEY S E, SMITH G P. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes[J]. Gene, 1988, 73(2): 305-318.

3. [3]MCCAFFERTY J, GRIFFITHS A D, WINTER G, et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains[J]. Nature, 1990, 348(6301): 552-554.

4. [4]WINTER G, MILSTEIN C. Man-made antibodies[J]. Nature, 1991, 349(6309): 293-299. https://doi.org/10.1038/349293a0.