无菌小鼠口-直肠定植操作程序

在通过冻存菌株定植之前（菌悬液约含14%甘油），小鼠应被放在适当的无菌环境中（隔离箱、等容笼/无菌笼）。

gnotobiotic小鼠饲养条件与模型特性对比

(A) gnotobiotic小鼠隔离器实物图： 用于无菌小鼠饲养与悉生模型构建的密封隔离系统，可维持无菌 / 特定菌群的受控环境，是研究gnotobiotic小鼠模型构建的核心设备。

(B) gnotobiotic小鼠与 SPF 小鼠肠道菌群特性示意图：gnotobiotic小鼠（上）的肠道菌群组成明确、菌株数量可控；SPF 小鼠（下）的肠道菌群复杂且组成不明确，实验可重复性受供体差异影响较大。

此操作必须在经过消毒（如Virkon 1%，Clidox，紫外线等）、完全无菌的区域进行，例如灭菌后的超净工作台，以减少污染风险。

所使用的设备和工作区域应先灭菌（并在放入超净台前消毒），操作人员需穿无菌工作服，戴无菌手套并进行手部消毒。

无菌操作由两个人同时进行，方法类似于(Paik et al., 2015)中描述的方式。

菌株应保持冷冻状态直至最后一刻；在设备、人员和小鼠笼准备就绪后再解冻。

冻存菌株含严格厌氧菌，因此解冻后暴露在氧气中的时间应尽量缩短，以获得最佳定植效果（在我们的操作中，解冻、混合并准备灌胃首只小鼠的总时间不超过四分钟）。

两种菌株必须混合，以形成OMM12或OMM19.1群体，如下所述。

操作步骤示例

1. 确保保种管和橡胶塞在使用前已消毒（即浸入消毒液，再用消毒湿巾擦拭，以减少消毒液进入试管的风险，或用酒精+火焰处理）。

2. 利用戴手套的手的热量快速解冻两个冷冻保种管（如OMM-basis和OMM-ext-1.2），倾斜试管以确保混合均匀。

3. 冻存菌株使用量由您的动物实验方案决定。就本方法示例而言，我们每只小鼠接种150 µl冻存菌株溶液。

gnotobiotic小鼠模型构建的关键变量与流程

影响因素包括：定植日龄（如断奶期接种）、定植方法（如口灌胃）、定植时长与剂量方案；定植后需通过培养、镜检、测序等方法验证定植成功率，菌群复杂度越高，定植抗性越强。

每笼所需冻存菌株溶液量计算公式

(150 µl × 小鼠数量) + 100 µl额外用量（取决于灌胃针大小）

例如：4只小鼠/笼 = (150 µl × 4) + 100 µl = 总计700 µl

1. 完全解冻后，用针和注射器刺破保种管顶部。从第一支保种管（OMM-basis）取出总量的一半（例如350 µl）用于一笼小鼠，然后拔出针头。

2. 再从第二支保种管（例如OMM-ext-1.2）中取出剩余50%（例如350 µl），共计700 µl注射液。

3. 从第二支保种管内部取出一个小的厌氧气泡到注射器中，然后拔出针头。

4. 小心地上下翻转注射器3-4次，直至混合均匀，气泡应在注射器内移动，帮助混合。

5. 倾斜注射器和针头，将针头向上，取下针头并更换为灌胃针/喂食管。

6. 注射器针头向上，排出混合气泡，将灌胃针填充细菌悬液，准备首只小鼠接种。

注意：解冻到灌胃的总操作时间不应超过4-5分钟。

1. 将首只小鼠固定好后，口服接种50 µl，随后立即直肠接种 100 µl（直肠进入 5mm 即可）。流出是正常现象，尽量让小鼠排便5-10秒，有助于直肠接种。

2. 对笼内其他小鼠重复接种操作。确保同一笼使用同一支灌胃针，以保证快速操作。

3. 每笼小鼠使用新的冷冻菌株和新针头。

4. 如 Eberl et al. 2020 所述，此操作应在首次接种后72小时重复一次。

OMM12 和 OMM19.1 介绍

OMM12 和 OMM19.1 是源自 miBC（小鼠肠道细菌培养集）的人工构建合成菌群，所有菌株均经过分类学和功能学鉴定，经精心筛选以覆盖广泛的系统发育多样性，并涵盖小鼠肠道中多种关键微生物功能。

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gnotobiotic小鼠肠道菌群模型的梯度与特性对比。

不同肠道菌群定植状态的gnotobiotic小鼠模型及其特性梯度。从左至右依次为：无菌小鼠、单菌定植小鼠、最小微生物群落模型（如本研究采用的 OMM 系列简化菌群），以及复杂菌群模型。下方三角展示了不同模型的权衡特性：左侧模型（无菌 / 单菌 / 简化菌群）具有菌群组成明确、可重复性高、可控性强的优势；右侧模型更接近天然肠道微环境，物种互作与免疫成熟度更完善。

本研究采用的 OMM 简化菌群模型，处于两者之间，兼顾了实验可控性与生理相关性。

最初的 OMM12 菌群（Brugiroux 等人，2016）包含的细菌可模拟复杂肠道菌群的多种功能；当补充 3 种兼性厌氧菌后，该菌群可使小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染产生定植抗性。此前已有研究证明，OMM12 在不同动物设施中均具有良好的定植可重复性（Eberl et al., 2020）。

OMM19.1 菌群在 OMM12 的基础上，加入了更多来自 miBC 的菌株，这些菌株覆盖了更广泛的分类学范围，功能也得到了拓展 —— 包括次级胆汁酸生成菌和纤维降解菌。定植 OMM19.1 的小鼠，其生理和免疫表型与无特定病原体（SPF）小鼠更为接近。

OMM19.1 的定植可重复性也已在代际间和多个动物设施中得到验证。但由于检测方法和定植方案的差异，仍存在一定的变异性。为减少这种变异，建议使用标准化的冷冻保藏菌种（如此处由 DSMZ 提供的）进行定植。

基于无菌（GF）小鼠的不同型号。

（A）Gnotobiotic 模型：可以由一种细菌（微生物 A）定殖小鼠，以获得 A-mono 相关小鼠。同样，无麸质小鼠可以被微生物 A 和 B 定殖，获得 A + B 二离子结合的小鼠。当小鼠被碱性微生物群（如变异的谢德勒菌群（ASF）定殖时，我们得到的微生物群简化。

（B）非菌体模型：当小鼠被健康或不健康个体（通常伴有菌群失调）的人类微生物群定殖时，我们得到的是具有人类相关微生物群（HMA）的小鼠。

操作流程说明

OMM  冷冻保藏菌种以 1mL / 管的细胞悬液形式提供，其中甘油浓度约为 14%。菌液保存于 - 80℃的密封玻璃小瓶中，分装过程在厌氧条件下完成。定植一笼小鼠（根据笼盒规格，最多可饲养 6 只），需要2 管 OMM 基础混合物（OMM-basis） + 1 管扩展混合物菌种（可配制成 OMM12 或 OMM19.1 菌群）。

一、寡鼠微生物群10株混合

DSM Mix OMM.basis10

二、寡鼠微生物群2型菌株扩展

DSM Mix OMM.ext1.2

三、寡鼠微生物群9型菌株扩展

DSM Mix OMM.ext2.9

相关链接：https://www.dsmz.de/collection/catalogue/microorganisms/microbiota/mouse-microbiota/oligo-mouse-microbiota#c3803