一、 穿梭载体构建与线性化
目的基因克隆：将目的基因IC通过酶切连接(XhoI+NheI)的方式，克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-EGFP的多克隆位点中。
系统选择：pShuttle-CMV-EGFP载体带有GFP绿色荧光标签，便于后续追踪转染和感染效率，插入片段容量相对更大。
用XhoI和NotI酶切质粒和pShuttle-CMV-EGFP载体质粒，获得粘性末端。
试剂 | 体积 |
XhoI | 1ul |
NheI | 1ul |
Buffer | 5ul |
产物 | 1ug |
水 | 至50ul |
37℃，酶切30min。
配置0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit回收酶切产物，使用紫外分光光度计计算产物浓度
3.连接
试剂 | 体积 |
T4 DNA Ligase | 1ul |
Buffer | 1ul |
PCR酶切产物 | 5ul |
载体酶切产物 | 3ul |
置于金属浴16℃连接3h。
4.转化
将1支Stbl3大肠化转感受态从-80冰箱取出，置于冰上融化。向Stbl3大肠化转感受态，加入连接产物，每支10μl，置于冰上30min。42℃热激活30s。置于冰上5min。向Stbl3大肠化转感受态加入1ml无抗LB，37℃，250rpm，激活1h。离心菌株，取含1%Amp的LB琼脂平板，向平板滴加菌液并涂布均匀。置于37℃培养过夜。
5.菌株筛选
各菌板挑取8个菌落，分别置于500ul 卡那霉素 LB中扩增，同时进行菌落PCR
菌落PCR体系
试剂 | 体积 |
2 × Taq Master Mix (Dye Plus) | 10ul |
F(10uM ) 引物 | 1ul |
R(10uM ) 引物 | 1ul |
菌液 | 2ul |
水 | 至20ul |
每个菌板配置180μl（8个样本）反应程序：预变性94℃ 2min，变性98℃ 10s，退火56℃ 30s，延伸68℃ 1min30s，共计30个循环，终延伸68℃，5min。
配置0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，挑选阳性菌株。选择1#菌株使用30ml LB进行扩增，取15ml菌液提取质粒，剩余菌液冻存至-80℃冰箱。
